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基因治療解決方案

基因治療（gene therapy）藥物一般通過將外源基因（或基因編輯工具）導入靶細胞或組織，替代、補償、阻斷、修正、增加或敲除特定基因以發揮治療作用^[1]。按照基因導入人體的方式不同，基因治療可分為ex vivo療法（體外離體療法）和in vivo療法（體內療法）。Ex vivo療法一般在體外將外源基因（或基因編輯工具）導入細胞，制備成為經基因修飾的細胞或細胞衍生產品，最終經回輸以發揮治療作用。In vivo療法將外源基因（或基因編輯工具）通過非病毒載體（如LNP）或病毒載體（如腺相關病毒AAV、慢病毒LV等）導入人體發揮治療作用。

Fig. 1 基因治療^[1][2]

體外酶法合成DNA載體

體外酶法合成DNA載體可以有效替代傳統的質粒DNA生產，完美避開生物發酵過程的諸多不可控風險，并且可以在更短的時間內完成工業化生產，達到加快生產、降低成本的目的。在基因治療領域主要應用于制備AAV、LV等病毒載體。

01 phi29 DNA Polymerase

phi29 DNA polymerase具有很強的鏈置換活性和連續合成的特性，可用于在體外合成雙鏈DNA。

注：在某些應用場景下，使用此酶會有專利限制

02 TelN Protelomerase

TelN Protelomerase可用于合成線性閉合mini DNA載體，其在識別位點 TelRL（56bp）切割雙鏈DNA，并在酶切位點處留下共價封閉的發夾結構，有效地將環狀DNA轉化為有發夾末端的線性DNA。在實際應用中會將質粒上的目的片段和骨架序列通過TelRL位點間隔。

注：TelRL底物序列需要專利授權

Fig.2 TelN Protelomerase可有效將環狀DNA轉化為有發夾末端的線性DNA，其活性與知名供應商相當。在50 μl體系中加入513 fmol dsDNA和不同酶量的TelN Protelomerase（由5 U/assay依次2倍梯度稀釋，NC為陰性對照），30℃反應30 min。

03 限制性內切酶

經TelN Protelomerase切割-連接形成的DNA載體有兩類，一類含骨架序列，一類含目的片段。骨架序列上有相應的限制性酶切位點，愷佧生物提供高活性的限制性內切酶用于酶切骨架序列。

04 Exonuclease III

經TelN Protelomerase切割-連接形成的DNA載體有兩類，一類含骨架序列，一類含目的片段。骨架序列上有相應的限制性酶切位點，經酶切后形成平末端或粘性末端，進一步經Exonuclease III作用，達到降解骨架序列，富集目的片段的目的。

Fig. 3 Exonuclease III有效降解BsaI線性化的雙鏈DNA（BsaI酶切后形成5’突出末端），而對TelN Protelomerase線性化的雙鏈DNA無影響(TelN Protelomerase線性化形成帶有發夾末端的線性DNA )。在20 μl反應體系中加入2 μg 經BsaI/TelN Protelomerase處理過的雙鏈DNA和100 U Exonuclease III，37℃下反應30 min。

基因編輯療法

01 Cas9、AsCas12a、hfCas12Max^?等基因編輯核酸酶

主要參與細胞與基因治療藥物（如造血干細胞、T細胞等）的基因修飾, 其中，GMP級Cas9核酸酶于高標準的CGT蛋白酶GMP生產車間生產，并經體外胞內雙重驗證。已完成DMF備案（編號：036578），并已協助客戶完成IND申報；hfCas12Max^?是輝大基因（HuidaGene）自主開發的新型DNA基因編輯工具酶，愷佧生物獲得在大中華區研究級蛋白的生產銷售排他許可，以及GMP級產品的生產銷售普通許可。

Fig. 4 Cas9核酸酶體外切割DNA實驗，三批次的Cas9核酸酶的體外切割效率基本相當。

Fig. 5 Cas9核酸酶用于293T細胞、Jurkat細胞、T細胞的基因敲除，其在不同細胞中的基因敲除效率與競品相當。

Fig. 6 hfCas12Max^?RNP 電轉 CD3+ T 細胞后，TIDE 分析B2M 和TRAC 基因敲除效率都超過 90%。

Fig. 7 經流式檢測，由 hfCas12Max^?介導的基因編輯系統可以高效地同時敲除 CD3+ T 細胞的 B2M和TRAC ，雙基因敲除效率超過 90%。

02 AccuBase^?胞嘧啶堿基編輯器

AccuBase^?是通過基因工程手段設計的CBE，將窗口范圍內的 C 脫氨形成 U，U利用細胞內修復機制轉變為 T，從而實現C→T的轉變，在編輯的過程中不會引入 DSB，確保了編輯的安全性。此外，創造性地將脫氨酶可逆的包裹起來，只有當 sgRNA 與靶位點結合時才能發揮脫氨作用，大幅度降低了與非靶 DNA 的隨機結合，可以實現接近零脫靶的效果，同時維持高效的編輯活性。

Fig. 8 使用AccuBase^?分別敲除原代T細胞的PDCD1, TRAC和B2M基因，經流式分析，在蛋白水平上，AccuBase^?對PD1和B2M的敲除效率超過80%，對TRAC的敲除效率達到96%。

Fig. 9 利用GOTI（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection）分析AccuBase^?在全基因組的脫靶水平，發現相比對照組的編輯器（檢測出700多個SNV），AccuBase^?得到的SNV與GFP對照組水平接近。

03 Cas9 (CRISPR Associated Protein 9) ELISA Kit

定量檢測基因編輯細胞藥物在回輸人體之前胞外或胞內中Cas9核酸酶的殘留。試劑盒檢測范圍為0.25 ng/ml-16 ng/ml，靈敏度可達0.125 ng/ml。

標準曲線

Fig. 10 擬合標準曲線，R²達到0.9997。

準確度

使用同一試劑盒測試高中低三個不同濃度的Cas9核酸酶在稀釋緩沖液中的加樣回收率。

Fig. 11 在稀釋緩沖液中檢測不同濃度Cas9樣本的加樣回收率均介于80%-120%，表明本試劑盒檢測Cas9核酸酶殘留的準確度高。

精密度

批內精密度

使用三批次試劑盒分別對高中低三個不同濃度的Cas9核酸酶進行檢測，每個樣本重復檢測10次，計算這10次檢測的平均值(M)和標準差(SD)，計算變異系數(CV)。

如Table 1所示，每批次試劑盒檢測高中低三個不同濃度的Cas9樣本的CV均小于10%，表明試劑盒對Cas9的殘留檢測具有良好的批內重復性。

批間精密度

使用三批次試劑盒對高中低三個不同濃度的Cas9核酸酶進行檢測，每個樣本使用同批次檢測10次，三批次共檢測30次，計算這30次檢測的平均值(M)和標準差(SD)，計算變異系數(CV)。

如Table 2所示，每個樣本三個批次間的CV均小于15%，表明試劑盒對Cas9的殘留檢測具有良好的批間重現性。

04 AAV Titration ELISA Kit

AAV是基因治療領域常用的病毒載體，AAV病毒顆粒滴度的檢測方法有Dot blot、TEM、AUC、ELISA、SEC-MALS等。愷佧生物開發了AAV2/5/6/8/9 Titration ELISA Kit，旨在為AAV病毒顆粒滴度的測定提供更便捷、更可靠的解決方案。

標準曲線

Fig. 12 擬合AAV9 Titration ELISA Kit的標準曲線，其定量范圍為2.03E+07-1.30E+09 capsids/ml。

特異性

ELISA間接法檢測不同濃度的AAV9抗體與AAV2/5/8/9交叉結合，以檢測抗體的濃度為橫坐標，OD₄₅₀值為縱坐標繪制曲線；ELISA夾心法檢測AAV9抗體與完整AAV9以及變性AAV9的結合，以AAV9的顆粒滴度為橫坐標，OD₄₅₀值為縱坐標繪制曲線。

Fig. 13 AAV9檢測抗體與AAV2/5/8/9交叉結合，結果顯示AAV9檢測抗體只特異性結合AAV9，不會交叉結合AAV2/5/8的衣殼蛋白。

Fig. 14 AAV9檢測抗體與變性AAV9結合檢測，結果顯示AAV9檢測抗體不結合變性的AAV9衣殼。

準確度

使用同一試劑盒測試高中低三個不同滴度AAV9樣本在稀釋緩沖液中的加樣回收率。

Fig. 15 在稀釋緩沖液中檢測不同滴度AAV9樣本的加樣回收率均介于80%-120%，表明本試劑盒檢測AAV9滴度的準確度高。

05 MaxNuclease全能核酸酶

在基因治療領域，主要用于藥物生產過程中去除宿主DNA和質粒DNA等雜質，GMP級MaxNuclease全能核酸酶于高標準的CGT蛋白酶GMP生產車間生產，不使用含動物源原材料，分析方法經系統驗證，并經過全方位的QC放行檢測，滿足從研發到商業大規模生產的使用需求，并且已完成DMF備案（編號：036799）。

Fig. 16 MaxNuclease降解核酸效果

06 MaxNuclease ELISA Kit

定量檢測基因治療藥物中MaxNuclease全能核酸酶的殘留，試劑盒檢測范圍為46.88 pg/ml-3000 pg/ml，靈敏度可達23.44 pg/ml。

Fig. 17 擬合標準曲線，R²達到0.9995。

產品列表

貨號	產品名稱	規格
PHI-BE101	phi29 DNA Polymerase	500 U/5000 U	立即詢價
TLN-BE001	TelN Protelomerase	10 kU/50 kU	立即詢價
BSA-EE101	Bsal	1000 U/5000 U	立即詢價
GMP-BSA-EE101	Bsal(GMP grade)	20 kU/400 kU	立即詢價
BSP-BE101	BspQl	1000 U/10 kU	立即詢價
SAP-SE101	Sapl	1000 U/10 kU	立即詢價
SAP-SE102	Sapl V2.0	1000 U/10 kU	立即詢價
XBA-EE101	Xbal	2000 U/20 kU	立即詢價
EXO-EE101	Exonuclease III	500 U/5000 U	立即詢價
KACTUS-CAS9	Cas9 Nuclease	1 mg/3 mg	立即詢價
KACTUS-CAS9-GMP	Cas9 Nuclease (GMP grade)	3 mg	立即詢價
CAS-MM00B	Cas9 (CRISPR Associated Protein 9) ELISA Kit	96 T	立即詢價
CAS-EE111	SpCas9 D10A Nickase	1 mg	立即詢價
CAS-EE121	AsCas12a Nuclease	1 mg	立即詢價
CAS-EE128	hfCas12Max^?	500 μg/1 mg	立即詢價
KD-0001	BS-EP1（Trade name: AccuBase^?）	200 μg/500 μg/1 mg	立即詢價
GMP-KD-0001	BS-EP1（Trade name: AccuBase^?), GMP grade	1 mg	立即詢價
AV2-MM00B	AAV2 Titration ELISA Kit	96 T	立即詢價
AV5-MM00B	AAV5 Titration ELISA Kit	96 T	立即詢價
AV6-MM00B	AAV6 Titration ELISA Kit	96 T	立即詢價
AV8-MM00B	AAV8 Titration ELISA Kit	96 T	立即詢價
AV9-MM00B	AAV9 Titration ELISA Kit	96 T	立即詢價
NUC-SE101	MaxNuclease全能核酸酶	50 kU/250 kU/5 MU	立即詢價
GMP-NUC-SE101	MaxNuclease全能核酸酶(GMP grade)	250 kU/5 MU	立即詢價
NUC-SE00B	MaxNuclease ELISA Kit	96 T	立即詢價